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蓝莓常见品种鉴别技术规程 Construction of Blueberry Fingerprint Based on EST-SSR Marker and Identification Criteria of Blueberry Varieties 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 - ×× - ××发布 ×××× - ×× - ××实施 辽宁省市场监督管理局 发布
目 次 目 次 I 前 言 III 蓝莓常见品种鉴别技术规程 1 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 3.1 PCR 1 3.2 SSR标记 1 3.3 指纹图谱 1 3.4 品种鉴定 1 4 试验准备 1 4.1 仪器与试剂 1 4.2 溶液配置 1 4.3 引物信息 2 5 操作程序 2 5.1 样品准备 2 5.2 DNA提取 2 5.3 DNA质量检测 2 5.4 PCR扩增 2 5.5 PCR产物检测 3 6 结果分析 3 6.1 指纹图谱的构建 4 6.2 品种鉴定 4 附录A 5 A.1 仪器 5 A.2 试剂 5 附录B 6 B.1 1mol•L-1 NaOH 6 B.2 1mol•L-1 Tris-Cl（pH 8.0）溶液 6 B.3 0.5mol•L-1 EDTA（pH 8.0）溶液 6 B.4 1×TE 6 B.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂 6 B.5.1 70 %乙醇 6 B.5.2 5×TBE缓冲液 6 B.5.3 1×TBE缓冲液 6 B.5.4 10 %APS 6 B.5.5 12 %聚丙烯酰胺凝胶溶液（40ml） 6 B.5.6 染色液 6 B.5.7 显色液 6 B.5.8 固定/终止液 6 附录C 8 附录D 9 附录E 10 附录F 11 附录G 12 前 言 本标准按照GB/T 1.1给出的规则起草。 本标准由辽宁省林业和草原局提出并归口管理。 本标准主要起草单位:大连大学 本标准起草人：徐国辉，王贺新，楚立威，娄鑫，崔青青，温立柱，赵倩，周永斌。 本标准为首次发布。 本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省林业和草原局（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23448927。 文件起草单位通讯地址：大连大学（大连市经济技术开发区学府大街10号），联系电话：0411-87402146。
蓝莓常见品种鉴别技术规程 1 范围 本规程规定了基于简单重复序列（Simple sequence repeats，SSR）标记分析与构建12个蓝莓常见品种的DNA指纹图谱过程中的的试剂配置、DNA提取、PCR扩增、PCR产物检测等技术要求。 本规程适用于对12个蓝莓常见品种的快速鉴定及差异分析。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 PCR 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR)，是以DNA为模板，在DNA聚合酶，引物，dNTP的共同参与下使目标片段扩增并用于检测分析。 3.2 SSR标记 根据基因组测序得到的序列，在SSR序列两端的序列设计特异性引物，利用PCR技术进行扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并鉴定的大小不同的扩增产物片段。 3.3 指纹图谱 利用不同SSR标记，在不同蓝莓品种提取的DNA中进行PCR扩增与凝胶电泳检测，对得到的不同大小的DNA片段进行统计分析，整理得到的指纹图谱。 3.4 品种鉴定 对供试材料进行DNA提取，利用SSR标记进行PCR扩增与凝胶电泳检测，并进行统计分析，与构建好的指纹图谱进行比对鉴定的研究方法。 4 试验准备 4.1 仪器与试剂 见附录A。 4.2 溶液配置 见附录B。 4.3 引物信息 用于构建指纹图谱与品种鉴定的引物的相关信息见附录C。 5 操作程序 5.1 样品准备 选取蓝莓新鲜叶片，-20℃运输，-80℃进行长期保存，本研究中所用蓝莓参照品种见附录D。 5.2 DNA提取 对于采集的新鲜嫩叶，使用试剂盒（TIANGEN）进行DNA提取。根据操作指南，步骤如下： （1）处理材料：取植物新鲜叶片20mg，加入液氮充分碾磨后转移至1.5ml离心管中，加入400µl缓冲液LP2和6 µlRNase A(10 mg/ml)，漩涡震荡1 min，室温放置10 min。 （2）加入130µl缓冲液LP2，充分混匀，漩涡震荡1min。 （3）12,000 rpm(~13,400)离心5 min，将上清移至新的离心管中。 （4）加入1.5倍体积的缓冲液LP3（例如500 µl的上清液加750 µl缓冲液LP3），立即充分振荡混匀15 sec。此时可能会出现絮状沉淀。 （5）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm(~13,400×g)离心30 sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。 （6）向吸附柱CB3中加入600µl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm(~13,400×g)离心30 sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。 （7）重复操作步骤6。 （8）将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 （9）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 µl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，将溶液收集到离心管中，以待检测。 5.3 DNA质量检测 （1）琼脂糖凝胶电泳检测DNA 取5μL提取的DNA原液，在100V的电压下，用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳20 min左右，取出凝胶，在紫外凝胶成像系统上观察电泳条带，观察条带是否单一，是否有拖尾。 （2）酶标仪检测； 吸取1.5μL提取的DNA原液，通过Nano Drop进行检测，鉴定DNA浓度和质量，是否有RNA污染，蛋白质或者酚污染。 5.4 PCR扩增 5.4.1 反应体系 SSR 的反应体系：正反向引物（10 µmol/L）各1µl、2*Taq PCR Master Mix 8µl、模板100ng、添加灭菌超纯水至20µl。 5.4.2 反应程序 94℃ 预变性 10 min；94℃变性 40 s，52℃退火 70 s，72℃延伸 2 min，35 个循环，72℃延伸 10 min。 5.5 PCR产物检测 扩增产物用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测拍照分析。 5.5.1 凝胶制备 将洗净晾干的玻璃板用水平灌胶的方式组装玻璃板，铁夹固定，取8mL 5×TBE，16mL30 %丙烯酰胺，15mL去离子水于烧杯中，加入0.28ml的10%APS，14ul的TEMED (每100ml聚丙烯酰胺加35ulTEMED)，混匀灌入板中，插入梳子，等待聚合，拔出梳子，吸取多余的水，装板。 5.5.2 点样 用微量移液器取3-5ul（具体数值依据点样孔大小确定）PCR产物加入样品槽，每加一个样品后，在电泳液中吸打清洗移液器两次，最后加入marker用于区分不同大小的条带。 5.5.3 电泳 加样完毕后，加入电极缓冲液，上槽电极缓冲液要没过矮玻璃板，下槽电极缓冲液要没过玻璃板下方边缘，将电源线正极接下槽，负极接上槽。电压为120V，根据指示剂位置调整时间，电泳到样品与marker到达胶板的末端处时停止电泳，电泳时间约为2h。 5.5.4 银染显色 a) 玻璃板的分离：电泳结束之后，小心地将长、短玻璃分开； b) 固定胶：将粘在一起的聚丙烯酰胺的长玻璃板放入塑料浅盘中，加入固定液，将玻璃板在摇床上缓慢摇动20min或至电泳示踪液消失。凝胶可在固定液中静止过夜。回收固定液，以备终止显色反应时使用。 c) 洗胶：将凝胶浸入蒸馏水中，清洗两次，每次约10s，然后取出，沥干水分，立即放入盛有预冷的显色液塑料盘中，凝胶从超纯水中取出到反应液中的时间不要超过5s。 d) 显色反应：凝胶在显色液中摇动至出现第一条带，然后将凝胶转置剩余的1L预冷的反应液中，继续进行显色，直至全部条带出现。 e) 终止显色反应：向反应液中加入2L的固定/终止液，然后在摇床上摇动3～5min，进行终止显色反应。 f) 洗胶：用蒸馏水漂洗凝胶两次，每次约2min。 g) 干胶：通过热对流或室温放置，使胶变干，然后在浅色的背景下扫描照相。 5.5.5 成像 银染结果于GE Image ScannerIII 型凝胶成像仪上进行观察拍照。 6 结果分析 6.1 指纹图谱的构建 将设计的100对SSR引物，在选取的12个蓝莓常见品种中进行多态性筛选，得到7对多态性高、稳定性好且带型容易识别的引物，进一步选取其中能够将12个蓝莓常见品种进行完全区分的4个核心引物SSR1007、SSR1183、SSR160、SSR1153。对于四对引物在12个供试蓝莓品种中的扩增结果进行记录，扩增结果见附录E。每对引物只分析目标条带附近的扩增位点，按照电泳图中从上到下依次命名为A、B、C、D 等，将其整理为数字指纹图谱，图谱见附录F。 6.2 品种鉴定 将需要进行品种鉴定的材料根据操作程序进行赝品准备,DNA提取，DNA质量检测，PCR扩增与PCR产物检测，将统计得到的条带情况与前期构建的指纹图谱进行比对，得到与指纹图谱中一致的品种名称，结合表型，对于需要鉴定的材料进行品种鉴定，并出具鉴定报告，鉴定报告见附录G。
附录A （资料性） 仪器与试剂 A.1 仪器 高压灭菌锅（105 ℃～ 136 ℃，最大工作压力0.22 MPa）；凝胶自动扫描仪（400百万像素）；高速冷冻离心机（最大离心力不小于15000 g）；PCR扩增仪（0 ℃～100 ℃）；多功能酶标仪；恒温水浴锅（室温～99 ℃）；电子天平（最小显示0.0001 g）；电泳槽（样品通量1.0 mm厚）；磁力搅拌器（0 r/min～2500 r/min，室温～100 ℃）；酸度计（-2.00～20.000 pH）；微量移液器（2 µl、10 µl、100 µl、200 µl、500 µl和1000 µl）。 A.2 试剂 TIANGEN新型植物组DNA试剂盒、液氮、无水乙醇、琼脂糖、Gold View染料、6×loading buffer、冰乙酸、琼脂糖、2000 bp DNA Ladder、100 bp DNA Ladder 、2*Taq PCR Master Mix、乙二胺四乙酸二钠（ EDTA-Na2）、三羟基甲基氨甲烷（Tris）、丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵（APS）、硝酸银（AgNO3）、氢氧化钠（NaOH）、37%甲醛、SSR引物、灭菌超纯水。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。
附录B （资料性） 溶液配制 B.1 1mol•L-1 NaOH 4 g NaOH，加水定容至100 mL。 B.2 1mol•L-1 Tris-Cl（pH 8.0）溶液 称取121.1 g Tris，加水定容至1 L，浓盐酸调至pH 8.0，高压灭菌备用。 B.3 0.5mol•L-1 EDTA（pH 8.0）溶液 称取186.1 g EDTA-Na2 ，800 mL水，加热定容至1 L，1 mol•L-1 NaOH调至pH 8.0，高压灭菌备用。 B.4 1×TE 1 mL 1 mol•L-1 Tris-HCl（pH 8.0），0.2 mL 0.5mol•L -1 EDTA（pH 8.0），加水定容至100 mL。 B.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂 B.5.1 70 %乙醇 700 mL无水乙醇，加水定容至1 L。 B.5.2 5×TBE缓冲液 分别称取 54 g 三羟基氨基甲烷，27.5 g 硼酸，加入 800 mL水加热溶解，再加入0.5 mol•L-1 EDTA（pH8.0）溶液20mL，加水定容至1 L。 B.5.3 1×TBE缓冲液 200 mL 5×TBE，加水定容至1 L。 B.5.4 10 %APS 0.5 g APS溶于5 mL水中。 B.5.5 12 %聚丙烯酰胺凝胶溶液（40ml） 30% 丙烯酰胺16ml、5×TBE 8ml、10% 过硫酸铵0.28ml、TEMED 0.014ml、加水15ml、4 ℃条件下保存。 B.5.6 染色液 1L的蒸馏水中加入3g的硝酸银和5mL的冰乙酸、100mL无水乙醇。 B.5.7 显色液 1L的超纯水中加30g的NaOH，冰浴冷却，使用前加入5mL 37%甲醛。 B.5.8 固定/终止液 将5mL的冰乙酸和100mL的无水乙醇加入到500mL蒸馏水中，定容至1L。
附录C （规范性） 引物信息 编号 | 引物名称 | 引物序列(5'→3') | 退火温度℃ | 1 | SSR160 | F：CCACCTTCGGTGGTCTCCC R：TGGCAGCAGTTGAGGGAACA | 57 | 2 | SSR1007 | F：TCTCCCTTCTCTCTCTGCACG R：ACTGTGTTTGTACTTCCGCCCT | 58 | 3 | SSR1153 | F: TGCTTTCCCATTGACCTGCC R: AGGACGAGATTTGCCCAGCA | 56 | 4 | SSR1183 | F：TGGACTCATGTCACTGTACCCA R：TGGCCCACATTGATGTGATGTTT | 56 |
附录D （规范性） 参照品种名单 序号 | 品种名称 | 1 | 杜克 | 2 | 德雷帕 | 3 | 休伦 | 4 | 自由 | 5 | 蓝丝带 | 6 | 顶层 | 7 | 尾声 | 8 | 云雀 | 9 | 法新 | 10 | 优瑞卡 | 11 | 莱宝 | 12 | 艾露 |
附录E （规范性） 引物SSR160、SSR1007、SSR1153、SSR1183在12个蓝莓常见品种中的扩增图谱
附录F （规范性） 12个蓝莓主栽品种的SSR数字指纹图谱
附录G 规范性 蓝莓品种SSR指纹图谱鉴定报告 送检样品编号 |
| 送检样品名称 |
| 对照品种编号 |
| 对照样品名称 |
| 送检人 |
| 检测单位 |
| 依据标准 |
| 检测引物数量：
检测引物编号：
SSR指纹图谱检测结果：
检测差异引物和谱带：
结论：
| 评语：
检测单位（公章） 年 月 日
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发表于 2022-4-8 11:25:53
